自体软骨移植是一种治疗软骨缺损的理想方法。与传统手术相比，自体软骨移植的患者能获得长期预后和更高的功能要求。但由于自体软骨来源有限且术中取材易导致创伤，该技术的推广应用受到了限制[1]。目前采用基因诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)成软骨分化，构建“生物工程软骨”有望弥补这些不足，该领域已成为软骨修复的研究热点[2]。骨形态蛋白2(bone morphogengetic protein 2,BMP2)是目前公认的诱导MSCs成软骨分化的良好而又安全的诱导因子[3, 4]。然而BMP2在诱导MSCs成软骨的同时还上调了不利于成软骨的因子，如上调了软骨抑制因子Smad7(mothers against decapentaplegic homolog 7)，它可破坏成软骨进程以及软骨细胞的稳定性[5, 6]。因此，联合应用其他因子去增强BMP2成软骨效应，可能是消除这一不利因素的有效策略。本课题组前期研究发现了一个“增强因子”——人性别决定区Y框蛋白9(sex determing region Y-related high mobility group-box gene 9，Sox9)可在明显增强BMP2诱导成软骨进程的同时，抑制软骨细胞骨化，但单独运用Sox9却不能发挥这些作用，其作用机制不明[7]。本研究拟初步探明Smad7是否是Sox9协同BMP2成软骨的作用靶点之一，即Sox9增强BMP2成软骨效应是否与其下调Smad7有关，以期为揭示BMP2基因强化生物工程软骨的机制和临床应用奠定基础。 1 材料与方法 1.1 细胞与重组腺病毒
采用小鼠骨髓间充质干细胞株(C3H10T1/2)以及人胚肾293细胞株(HEK293)，重组腺病毒Ad-BMP2、Ad-Sox9，对照重组腺病毒Ad-GFP均由美国芝加哥大学分子肿瘤研究室主任何通川教授惠赠。 1.2 主要试剂
胎牛血清(FBS)购自Bionid公司，DMEM培养基和胰蛋白酶均购自HyClone公司，青链霉素、蛋白酶抑制剂(PMSF)、细胞裂解液、鼠单克隆GAPDH抗体、SDS蛋白上样缓冲液、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG抗体等均购自上海碧云天生物技术有限公司，TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒、SYBR Green Supermix购自美国Bio-Rad公司，Real-time PCR引物皆由上海生工公司合成，引物序列参见表 1。鼠单克隆抗体Smad7购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体购自美国Abcam公司，免疫细胞化学试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司。
| 基因 | 引物序列(5′→3′) | 片段大小(bp) |
| Sox9 | 正义链：AGCTCACCAGACCCTGAGAA | 200 |
| 反义链：TCCCAGCAATCGTTACCTTC | ||
| BMP2 | 正义链：ACCAGACTATTGGACACCAG | 174 |
| 反义链：AATCCTCACATGTCTCTTGG | ||
| Smad7 | 正义链：AAGATCGGCTGTGGCATC | 230 |
| 反义链：CCAACAGCGTCCTGGAGT | ||
| OPN | 正义链：CCTCCCGGTGAAAGTGAC | 124 |
| 反义链：CTGTGGCGCAAGGAGATT | ||
| MMP13 | 正义链：GGAGCATGGCGACTTCTAC | 208 |
| 反义链：GAGTGCTCCAGGGTCCTT | ||
| GAPDH | 正义链：CTACACTGAGGACCAGGTTGTCT | 123 |
| 反义链：TTGTCATACCAGGAAATGAGCTT |
采用浓度为10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM培养基，在75 cm2细胞培养瓶中培养HEK293细胞，待细胞汇合度达60%～70%时加入适量腺病毒感染。4～5 d后，荧光显微镜下可见带有荧光的细胞比率接近90%，显微镜下观察HEK293细胞变圆，有40%～50%细胞脱落漂浮后，收集细胞悬液并低速离心，弃去上清液，在液氮与37 ℃水浴中反复冻融，裂解细胞，然后高速离心后收集细胞裂解液上清，测试病毒滴度后并保存。 1.3.2 C3H10T1/2细胞的培养及诱导分化
C3H10T1/2细胞用含10%胎牛血清和1%青链霉素的完全培养基在75 cm2细胞培养瓶中进行培养，待细胞生长至30%～40%时(传代后约24 h)，分为等量4组，分别加入适量Ad-GFP、Ad-BMP2、Ad-Sox9、Ad-BMP2+Ad-Sox9 病毒悬液感染细胞，以4组间具有相同荧光强度，且细胞生长状态良好作为病毒用量，感染24 h后在荧光显微镜下观察，一般感染率控制在40%～50%。 1.3.3 细胞总RNA的提取
按1.3.2的方法在6孔板中培养细胞，培养至所需时间，弃去培养液。用PBS清洗2次后，每孔加入1 mL TRIzol试剂，反复吹打5 min使细胞充分裂解，将混合液移至1.5 mL EP管，室温放置5 min后加入200 μL氯仿，剧烈振荡15 s，室温放置3 min。4 ℃低温离心，13 000 r/min，15 min。吸取上清加入600 μL异丙醇混匀，室温放置10 min。4 ℃低温离心，13 000 r/min，10 min，管底可见白色沉淀，吸弃上清，加入75%乙醇1 mL洗涤沉淀。4 ℃低温离心，10 000 r/min，5 min，弃上清，待其空干，加入25 μL DEPC水溶解RNA，检测RNA浓度。 1.3.4 RNA逆转录反应体系
将总RNA 500 ng、5×Iscript反应缓冲液2 μL、Iscript逆转录酶0.5 μL加入EP管，nuclease freewater 补足至10 μL。PCR设定反应条件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 保持。 1.3.5 Real-time PCR
按1.3.2的方法在6 孔板中培养C3H10T1/2 细胞，分别于第3、7、11天提取细胞总RNA，逆转录后行Real-time PCR，检测第3、7、11天 Smad7与11 d OPN与基质金属蛋白酶13(MMP13)mRNA相对表达水平。反应体系：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 5 s，40次；58～95 ℃每次上升0.5 ℃绘制溶解曲线。GAPDH做内参，每次反应设3个平行复孔和无模板阳性对照(NTC)，NTC未出现特异性扩增曲线。 1.3.6免疫细胞化学染色
按1.2.2的方法在24孔板中培养C3H10T1/2细胞，诱导分化11 d后，弃去培养基，PBS清洗细胞2次后，4%多聚甲醛固定30 min，之后按免疫细胞化学试剂盒说明行Smad7免疫细胞化学染色。 1.3.7 Western blot检测
按1.2.2的方法在6孔板中培养C3H10T1/2细胞，到达计划时间时，分别收集3 d BMP2组、Sox9组与7 d Ad-BMP2、Ad-Sox9、Ad-BMP2+Ad-Sox9、Ad-GFP细胞并提取总蛋白，采用BCA蛋白浓度测定法测定所获得的蛋白浓度。经SDS-PAGE蛋白电泳(每孔上样量约60 μg总蛋白)、半干转印、5%脱脂奶粉封闭1 h、4 ℃摇床孵育目标一抗过夜、洗膜、室温孵育二抗2 h后，化学发光检测，使用Quantity One软件进行图像采集。 1.4 统计学处理
计量资料以x±s表示，采用SPSS 19.0统计软件进行随机区组设计的方差分析，组间两两比较t检验。 2 结果 2.1 重组病毒感染间充质干细胞后目的基因表达
24 h后，Ad-BMP2、Ad-Sox9、Ad-BMP2+Ad-Sox9及Ad-GFP感染C3H10T1/2的感染率达40%～50%，细胞生长状态良好，可持续至感染后11 d(图 1)，表明重组腺病毒可有效感染C3H10T1/2。Western blot检测结果表明，目的基因BMP2、Sox9 均成功转入C3H10T1/2细胞并可稳定有效表达(图 2)。
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| A：BMP2组；B：Sox9组；C：GFP组 图 1 Ad-BMP2、Ad-Sox9及Ad-GFP感染C3H10T1/2细胞后的荧光蛋白表达 (荧光显微镜 ×100) |
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| A：Sox9蛋白表达 1： Sox9组；2：GFP组；B： BMP2蛋白表达 1：BMP2组；2：GFP组 图 2 Western blot检测各组重组腺病毒感染C3H10T1/2细胞目的蛋白表达水平 |
相应的重组病毒感染C3H10T1/2后，检测发现在BMP2组(3、7、11 d)与BMP2+Sox9组(3、7 d)中，其Smad7 mRNA表达水平均明显高于同时间点 GFP组(P<0.05)。第7、11天，BMP2+Sox9组Smad7 mRNA 表达明显低于BMP2组(P<0.05)，提示高表达Sox9可有效抑制BMP2上调的Smad7 mRNA表达。以上结果表明，BMP2在诱导成软骨进程的同时上调了Smad7，联用Ad-Sox9后，高表达Sox9可有力抑制Smad7 mRNA的表达，其中7、11 d效果最明显(P<0.05，图 3)。
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| a：P<0.05，与同时间GFP组比较；b：P<0.05，与同时间BMP2组比较 图 3 Real-time PCR检测 Sox9和BMP2对Smad7 mRNA 表达水平的影响 |
相应的重组腺病毒感染C3H10T1/2细胞第7天,与GFP组相比，BMP2组Smad7蛋白表达明显升高；而BMP2+Sox9组中Smad7蛋白表达明显弱于BMP2组；Sox9组染色深度与GFP组比无显著差异，但显著低于BMP2组和BMP2+Sox9组。免疫细胞化学染色与Western blot检测获得相似的结果(图 4、5)，表明Sox9可在蛋白水平抑制BMP2诱导下的Smad7高表达。
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| 1：BMP2组；2：Sox9组；3：BMP2+Sox9组；4：GFP组 图 4 Western blot检测感染第7天时各组Smad7蛋白表达水平 |
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| A：BMP2组；B：Sox9组；C：BMP2+Sox9组；D：GFP组 图 5 免疫细胞化学染色观察感染第7天时各组Smad7表达情况 (S-P ×200) |
重组腺病毒感染C3H10T1/2后，提取7 d样本中mRNA，逆转录后行Real-time PCR，检测结果显示，BMP2组OPN基因水平表达明显高于GFP组(P<0.05)，而BMP2+Sox9组中OPN表达量明显低于BMP2组(P<0.05)。MMP13在BMP2组中表达明显低于GFP组(P<0.05)，而BMP2+Sox9组比BMP2组中MMP13表达更低(P<0.05，图 6)。这表明Sox9显著抑制BMP2诱导下OPN的表达，并协同BMP2抑制了MMP13的表达。
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| 1：BMP2组；2：Sox9组；3：BMP2+Sox9组；4：GFP组 a：P<0.05，与GFP组比较；b：P<0.05，与BMP2组比较 图 6 Real-time PCR检测Sox9和BMP2对OPN(A)与MMP13(B) mRNA表达水平的影响 |
由于软骨组织缺乏血液供应，自我修复能力弱，临床传统的治疗方法不能为软骨缺损患者提供长期良好的预后。软骨移植技术，尤其是自体软骨移植虽然可提供良好的预后，但因软骨来源不足和创伤性取材，临床应用受到限制。基因强化的“生物工程软骨”可为软骨移植提供充足的修复材料，已成为研究热点。
BMP2因可有效地诱导MSCs成软骨分化而受到广泛关注。如在裸鼠皮下注射感染了Ad-BMP2的MSCs，可形成软骨结节[7]，而BMP2敲除鼠则无法形成正常软骨[8]。Jain等[9]也进一步研究证明了BMP2诱导成软骨的能力。此外BMP2已被美国FDA批准应用于脊柱手术中，其生物安全性已得到保证，因此BMP2在构建生物工程软骨方面具有广阔的应用前景。但BMP2在诱导软骨分化的同时也诱导了MSCs成骨进程[10]，并且上调了一系列抑制软骨形成的因子，从而阻碍了软骨的分化与稳定。故通过联合运用其他因子，去除或减弱以上不良因素，增强BMP2成软骨效应，可能是优化BMP2诱导的“生物工程软骨”的好方法。
我们前期研究发现，联合应用Sox9可有效提高BMP2成软骨能力，增强Col2al和Aggrean等一系列成软骨因子表达，在强化BMP2诱导软骨化的同时抑制了成骨因子表达，维持软骨稳定表型[7]，然而其作用机制尚不明确。Smad7作为BMP2下游的重要软骨抑制因子，在BMP2诱导下表达明显升高，在软骨化进程中起到了重要作用[3]。Smad7能通过阻断Smad1/5/8通路与MAPK通路抑制BMP2诱导的软骨化进程。高表达Smad7的小鼠，其软骨化进程受到完全抑制，说明Smad7可有效抑制干细胞软骨分化[10]。而敲除Smad7后小鼠生长板中软骨细胞最终成熟障碍，肥大区域加大，软骨细胞分化停滞，说明Smad7在软骨细胞最终分化中起到了重要作用[11]。研究发现，高表达Sox9可增强BMP2成软骨，同时抑制软骨细胞骨化，减小生长板肥大区域[7]。这一系列现象提示Smad7可能是Sox9协同BMP2成软骨的作用靶点之一。研究不同表达水平Smad7对BMP2诱导软骨化进程的影响将有利于进一步了解Smad7的作用。然而由于同时采用腺病毒表达Smad7，Sox9与BMP2细胞模型难以维持。Iwai等[10]研究发现高表达的Smad7可通过抑制Smad1/5/8与P38通路有力阻断BMP2诱导的软骨化。由于腺病毒表达水平难以控制，过高表达Smad7可能完全阻断BMP2诱导的软骨化进程，无法观察过程中各因子变化。因此本研究采用在BMP2诱导下内源性高表达Smad7的间充质干细胞为模型，观察Smad7在软骨化全过程中的作用，分析Sox9对其在BMP2诱导成软骨过程中的影响与作用。
本研究结果显示，BMP2诱导MSCs第3、7、11天时，Smad7 mRNA明显升高，而Sox9与BMP2联合应用时，在7 d与11 d，Smad7表达较BMP2单用组明显降低，提示Sox9可能下调了BMP2诱导的Smad7 mRNA 表达；Sox9与BMP2联合处理11 d，Smad7蛋白水平明显低于BMP2组，显示Sox9有效抑制了BMP2诱导下的Smad7蛋白水平的表达。结合前期我们的研究：Sox9与BMP2联用可明显上调Col2al等软骨形成因子表达这一现象[7]，可以认为Sox9可能通过抑制Smad7这一重要软骨负性因子，上调了BMP2下游的成软骨因子表达，增强了BMP2诱导软骨形成的能力。MMP13与OPN是软骨化过程中重要负性因子,其表达与Smad7密切相关。OPN是成骨重要标志因子，其表达升高提示软骨矿化进入软骨内成骨阶段[11]；MMP13能起到分解Col2al的作用，是促进软骨基质降解，破坏软骨形态的重要因子[12, 13]。两者表达的升高提示软骨细胞最终成熟，丧失软骨表型而逐渐被矿化。有研究发现，Smad7敲除鼠生长板内软骨最终成熟受到抑制，使得软骨细胞维持稳定[6]，该过程伴有MMP13与OPN因子在生长板内明显下调，提示Smad7表达与MMP13与OPN因子变化密切相关。我们前期研究发现Sox9可通过抑制成骨因子ALP与Runx2的表达，进而抑制软骨细胞肥大矿化[7]。为了进一步探讨Sox9对Smad7在软骨成熟方面的作用，我们关注了与Smad7密切相关的MMP13与OPN因子，发现感染11 d 时，高表达Sox9抑制Smad7表达的同时，也抑制了OPN和MMP13的表达，阻碍了软骨内骨化的进程。Wang等[12]也研究发现：BMP2可抑制MMP13表达，使MMP13维持在相对低的水平，加入Sox9可进一步增强BMP2抑制MMP13的作用。这些研究结果均提示：Sox9可能通过抑制Smad7及其成软骨负性相关因子的表达，阻断了软骨细胞最终成熟与矿化，维持了软骨形态。
综上所述，本研究初步探明了Sox9增强BMP2诱导成软骨的作用可能与其抑制了Smad7有关，即Sox9可抑制BMP2诱导下高表达的成软骨负性调控因子——Smad7的表达，从而进一步增强了BMP2成软骨的效应。Sox9在优化BMP2成软骨效应的同时，抑制软骨细胞的终末分化进程，保持了软骨细胞形态和基质的稳定。Smad7可能是Sox9发挥这些功效的作用靶点。然而由于Smad7作用的多样性与复杂性，不同表达水平的Smad7对BMP2诱导的软骨化是否起到不同作用尚待研究。Smad7在Sox9增强BMP2诱导的软骨化的详尽机制还有待进一步探索。
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