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新型姜黄素纳米粒对Lewis肺癌细胞增殖、凋亡的影响
李松霖, 谭群友, 王如文, 方春抒, 于 杰, 祁 迪    
(400042 重庆,第三军医大学大坪医院野战外科研究所胸外科,全军胸外科研究所)
摘要:目的 探讨一种新型的姜黄素纳米粒(curcumin nanoparticles,Cur-NPs)对Lewis肺癌细胞LLC增殖与凋亡的影响。方法 游离姜黄素(curcumin,Cur)和Cur-NPs分别作用于LLC细胞24 h,MTT检测其对LLC细胞的增殖抑制作用。20 μmol/L的药物作用于细胞24 h后,流式细胞术检测Cur-NPs 对细胞周期、细胞凋亡、细胞内活性氧、细胞内钙离子浓度、细胞线粒体膜电位的影响,并与Cur进行对照。结果 Cur-NPs可以明显增强Cur对LLC细胞的增殖抑制,IC50从34.91 μmol/L降为10.65 μmol/L (P<0.05)。Cur-NPs明显提高了Cur诱导LLC细胞凋亡(P<0.05)、抑制细胞周期于S期(P<0.05)、升高细胞内钙离子浓度(P<0.05)、升高细胞活性氧浓度(P<0.05)、降低细胞线粒体膜电位(P<0.05)的能力。结论 新型姜黄素纳米粒可明显提高游离姜黄素对LLC细胞的体外增殖抑制作用,可能与其促进细胞凋亡有关。
关键词: 姜黄素     纳米粒     Lewis肺癌     细胞增殖     凋亡    
Effect of novel curcumin nanoparticles on proliferation and apoptosis of Lewis lung cancer cells in vitro
Li Songlin, Tan Qunyou, Wang Ruwen, Fang Chunshu, Yu Jie, Qi Di    
(Department of Thoracic Surgery, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400042, China)
Abstract:Objective To determine the effect of novel curcumin nanoparticles (Cur-NPs) on the proliferation and apoptosis of Lewis lung cancer (LLC) cells in vitro. Methods LLC cells were cultured with different concentrations of Cur-NPs and free curcumin (Cur) for 24 h, and the cell proliferation was evaluated by MTT assay. After 20 mol/L of Cur-NPs and Cur treatment on LLC cells for 24 h, the cell apoptosis, cell cycle arrest, reactive oxygen accumulation, intracellular Ca2+ accumulation and mitochondrial membrane potential were analyzed by flow cytometry. Results Cur-NPs remarkably enhanced Cur-induced proliferation inhibition of LLC cells in vitro, and IC50 decreased from 34.91 to 10.65 mol/L (P<0.05). Cur-NPs significantly improved Cur-induced apoptosis (P<0.05), arrested cell cycle at S phase (P<0.05), increased reactive oxygen accumulation (P<0.05) and intracellular Ca2+ accumulation (P<0.05), and decreased mitochondrial membrane potential (P<0.05). Conclusion Cur-NPs can enhance Cur-induced proliferation inhibition in LLC cells, which may be related to promotion of cell apoptosis.
metformin: curcumin     nanoparticles     Lewis lung carcinoma     proliferation     apoptosis    

肺癌的发病率和病死率均居恶性肿瘤的首位[1],腺癌是肺癌的主要病理类型之一,近年来发病率呈上升趋势[2]。研究表明,从传统中药姜黄中提取的姜黄素,对乳腺癌、肺癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌等恶性肿瘤有较好的疗效,且没有明显的毒副作用,但由于口服给药生物利用度低,限制了其临床应用[3, 4]。姜黄素纳米粒可以增加姜黄素的水溶性,增加其稳定性,进而提高其生物利用度[5, 6]。本研究采用我们新近研制成功、稳定性好的一种新型姜黄素纳米粒(curcumin nanoparticles,Cur-NPs),体外考察其对Lewis肺癌细胞LLC增殖、凋亡的影响,并与游离姜黄素(curcumin,Cur)进行对比,旨在考察Cur-NPs是否能增强Cur对Lewis肺癌细胞增殖的抑制作用。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂

姜黄素购自美国Sigma公司,新型姜黄素纳米粒按我们前期研究的方法自制[6];DMEM、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司;MTT、propidium iodide (PI)、RNase A、细胞凋亡试剂盒Annexin V FITC-PI、钙离子检测探针Fluo-3、活性氧检测探针DCFH、线粒体膜电位检测探针Rhodamine123(Rho123)购自碧云天生物技术研究所。流式细胞术采用美国BD FAC-SVantage 型流式细胞仪。Lewis肺癌细胞LLC细胞系由第三军医大学新桥医院全军肿瘤研究所馈赠。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养

LLC细胞用含有10%新生胎牛血清(FBS)及0.5%青链霉素的DMEM培养基,在37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱培养,取处于生长对数期的细胞进行实验。 1.2.2 MTT法检测姜黄素纳米粒对LLC细胞增殖的影响

取对数期细胞,接种于96孔板中,每孔接种5 000个/100 μL,培养12 h细胞贴壁后,再加入等体积含不同浓度药物的完全培养基。设阴性对照组 (Ct组)、游离姜黄素组(Cur组)、新型姜黄素纳米粒组(Cur-NPs组)和纳米粒空白载体组(NPs组),每组设 3个复孔。药物终浓度设置为2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L 和40.0 μmol/L。培养24 h,每孔加入MTT 20 μL,继续培养4 h,彻底弃去上清液后,每孔加入DMSO 150 μL,振荡器充分振荡后,用酶标仪测定各孔在490 nm处的光密度D(490)值,按以下公式计 算细胞抑制率:细胞抑制率=[1-药物组D(490)/ 阴性对照组D(490)]×100%。实验重复3次。 1.2.3 细胞周期检测

将对数期细胞接种于6孔板,细胞贴壁后,用20 μmol/L的游离姜黄素、新型姜黄素纳米粒和纳米粒空白载体处理细胞。作用24 h后,胰酶消化并取细胞悬液移入离心管中离心,吸去上清液,洗涤2~3次,加入70%冷乙醇4 ℃固定细胞24 h,加入碘化丙啶(PI)、RNase,37 ℃孵育30 min后在流式细胞仪上测定细胞周期。 1.2.4 细胞凋亡检测

将对数期细胞接种于6孔板,细胞贴壁后,用20 μmol/L的游离姜黄素、新型姜黄素纳米粒和纳米粒空白载体处理细胞。作用24 h后,胰酶消化并取细胞悬液移入离心管中离心,吸去上清液,洗涤2~3次,加入Annexin V-FITC、PI染液,染色5 min后上机检测凋亡率。 1.2.5 细胞活性氧检测

将对数期细胞接种于6孔板,细胞贴壁后,用20 μmol/L的游离姜黄素、新型姜黄素纳米粒和纳米粒空白载体处理细胞。作用24 h后,去除细胞培养液,加入DCFH-DA染液,37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次,在流式细胞仪上检测荧光强度变化。 1.2.6 细胞内钙离子浓度检测

将对数期细胞接种于6孔板,细胞贴壁后,用20 μmol/L的游离姜黄素、新型姜黄素纳米粒和纳米粒空白载体处理细胞。作用24 h后,胰酶消化并取细胞悬液移入离心管中离心,吸去上清液,洗涤2~3次,加入Fluo-3荧光探针,染色30 min后在流式细胞仪上检测荧光强度变化。 1.2.7 细胞线粒体膜电位检测

将对数期细胞接种于6孔板,细胞贴壁后,用20 μmol/L的游离姜黄素、新型姜黄素纳米粒和纳米粒空白载体处理细胞。作用24 h后,胰酶消化并取细胞悬液移入离心管中离心,吸去上清液,洗涤2~3次,加入Rhodamine123荧光探针,染色30 min后在流式细胞仪上检测荧光强度变化。 1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件,结果以x±s表示,计量资料行student’s t检验。 2 结果 2.1 姜黄素纳米粒对LLC细胞增殖的影响

随着姜黄素浓度增加,细胞生长抑制率增加,在相同浓度下,姜黄素纳米粒提高了姜黄素对LLC细胞增殖的抑制率,空白载体对LLC细胞的增殖无明显影响。姜黄素对LLC细胞24 h的IC50为34.91 μmol/L,姜黄素纳米粒对LLC细胞24 h的IC50为10.65 μmol/L,差异有统计学意义(P<0.05,图 1)。

a:P<0.05,与NPs组比较;b:P<0.05,与Cur组比较 图 1 MTT检测不同浓度姜黄素及其纳米粒对LLC细胞的抑制作用
2.2 姜黄素纳米粒对LLC细胞凋亡的影响

与对照组比较,姜黄素可以诱导LLC细胞凋亡,姜黄素纳米粒可以提高其诱导凋亡的能力。20 μmol/L的药物作用LLC细胞24 h后,各组凋亡率分别为Ct组(4.94±0.81)%、NPs组(3.32±0.52)%、Cur组(7.43±1.13)%和Cur-NPs组(67.69±9.86)%。Cur-NPs组与Cur组比较,差异有统计学意义(P<0.05,图 2)。

A:Ct组;B:NPs组;C:Cur组;D:Cur-NPs组 图 2 姜黄素及其纳米粒对LLC细胞凋亡的影响
2.3 姜黄素纳米粒对LLC细胞周期的影响

与对照组比较,姜黄素可以阻滞LLC细胞周期于S期,姜黄素纳米粒可以提高其阻滞能力。20 μmol/L的药物作用LLC细胞24 h后,各组S期比例分别为Ct组(43.67±8.92)%、NPs组(64.43±10.12)%、Cur组(81.57±9.15)%和Cur-NPs组(92.20±7.65)%。Cur-NPs组与Cur组比较,有统计学差异(P<0.05,图 3)。

A:Ct组;B:NPs组;C:Cur组;D:Cur-NPs组 图 3 姜黄素及其纳米粒对LLC细胞周期的影响
2.4 姜黄素纳米粒对LLC细胞内活性氧的影响

Ct组及NPs组荧光强度较微弱,药物处理24 h后胞内活性氧浓度增加,姜黄素纳米粒的荧光强度高于姜黄素原料药的荧光强度。20 μmol/L的药物作用LLC细胞24 h后,各组活性氧荧光强度分别为Ct组(110.76±28.31)、NPs组(127.34±31.25)、Cur组 (2 088.01±238.19)和Cur-NPs组(2 568.67±361.85)。 Cur-NPs组与Cur组比较,差异有统计学意义(P<0.05,图 4)。

A:Ct组;B:NPs组;C:Cur组;D:Cur-NPs组 图 4 姜黄素及其纳米粒对LLC细胞活性氧的影响
2.5 姜黄素纳米粒对LLC细胞内钙离子浓度的影响

Ct组及NPs组荧光强度较微弱,药物处理LLC细胞24 h后胞内钙离子浓度增加,姜黄素纳米粒的荧光强度高于姜黄素原料药的荧光强度。20 μmol/L的药物作用LLC细胞24 h后,各组钙离子荧光强度分别为Ct组(28.99±3.91)、NPs组(35.79±4.85)、Cur组(52.11±11.28)和Cur-NPs组(97.85±15.68)。Cur-NPs 组与Cur组比较,差异有统计学意义(P<0.05,图 5)。

A:Ct组;B:NPs组;C:Cur组;D:Cur-NPs组 图 5 姜黄素及其纳米粒对LLC细胞内钙离子浓度的影响
2.6 姜黄素纳米粒对LLC细胞线粒体膜电位的影响

20 μmol/L的药物作用LLC细胞24 h后,各组线粒体膜电位荧光强度分别为Ct组(228.03±38.64)、NPs组(184.34±26.84)、Cur组(128.97±18.56)和Cur-NPs组(94.00±12.11)。姜黄素作用LLC细胞24 h后细胞线粒体膜电位降低,姜黄素纳米粒的膜电位更低,两者有统计学差异(P<0.05,图 6)。

A: Ct组;B: NPs组;C: Cur组; D: Cur-NPs组 图 6 姜黄素及其纳米粒对LLC细胞线粒体膜电位的影响
3 讨论

姜黄素是一种天然提取物,研究发现其有明显的抗癌活性而没有毒副作用,具有广阔的开发前景,美国国立肿瘤所(NCI)已经将其列为第3代防癌药物进行研究[7]。但由于游离姜黄素的不稳定、口服生物利用度低等缺点,研究者们一直试图通过制剂技术来改善其不稳定性,提高其生物利用度[8]。已有学者报道了游离姜黄素对多种肿瘤细胞的抑制作用[9, 10, 11],但是姜黄素及其纳米制剂对LLC细胞增殖与凋亡的影响的报道较少。

本课题组前期通过薄膜超声法制备姜黄素纳米粒,明显增加了姜黄素的溶解性和稳定性,提高了其生物利用度[6]。进而我们采用MTT检测发现游离姜黄素和姜黄素纳米粒均可抑制LLC细胞的增殖,二者对LLC细胞24 h内的IC50分别为34.91、10.65 μmol/L,表明姜黄素纳米粒可显著提高游离姜黄素对LLC细胞的增殖抑制作用。新型姜黄素纳米粒提高了姜黄素的溶解度,相对于游离姜黄素更容易进入细胞膜,通过细胞内吞或者其他转运方式进入细胞后,释放出游离姜黄素,提高了肿瘤细胞对姜黄素的摄取,而且新型姜黄素纳米粒更稳定,不容易氧化,可以更多地进入细胞。我们研究制的这种新型姜黄素纳米粒还有缓释效果,可以延长药效作用。由于上述的原因新型姜黄素纳米粒极明显提高了姜黄素对LLC细胞的抑制增殖能力。

凋亡是抑制细胞增殖的重要原因[12],因此我们采用流仪细胞技术检测了LLC细胞的凋亡情况,结果显示,同一浓度的姜黄素、姜黄素纳米粒作用LLC细胞24 h后,Ct组、Cur组和Cur-NPs组LLC细胞的凋亡率分别为4.94%、7.43%和67.69%,提示姜黄素可以诱导LLC细胞凋亡,姜黄素纳米粒可以显著提高其诱导凋亡的能力。姜黄素可以阻滞LLC细胞周期于S期,或许是姜黄素抑制细胞增殖的重要原因之一[6],而姜黄素纳米粒可以提高其阻滞能力。

活性氧、细胞内钙离子浓度和线粒体膜电位与细胞凋亡息息相关。本研究发现空载体荧光强度较微弱,药物处理24 h后胞内活性氧浓度增加,姜黄素纳米粒的荧光强度高于游离姜黄素。经药物处理24 h后LLC细胞胞内钙离子浓度增加,姜黄素纳米粒的荧光强度高于游离姜黄素。游离姜黄素作用LLC细胞24 h后细胞线粒体膜电位降低,新型姜黄素纳米粒的膜电位更低。

综上所述,姜黄素及其新型姜黄素纳米粒对LLC细胞增殖、生长有显著的抑制作用,而这种姜黄素纳米粒可明显提高游离姜黄素的抗癌效果。游离姜黄素及新型姜黄素纳米粒均可以诱导LLC细胞凋亡和抑制其细胞周期于S期。二者诱导LLC细胞凋亡可能与其增加细胞内钙离子浓度、细胞内活性氧和降低细胞线粒体膜电位相关[13],但其机制尚不清楚,需要今后进一步研究。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201408109
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李松霖,谭群友,王如文,方春抒,于 杰,祁 迪.
Li Songlin, Tan Qunyou, Wang Ruwen, Fang Chunshu, Yu Jie, Qi Di.
新型姜黄素纳米粒对Lewis肺癌细胞增殖、凋亡的影响
Effect of novel curcumin nanoparticles on proliferation and apoptosis of Lewis lung cancer cells in vitro
第三军医大学学报, 2015, 37(02): 141-145.
J Third Mil Med Univ, 2015, 37(02): 141-145.
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201408109

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收稿:2014-08-15
修回:2014-09-15

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