肺癌的发病率和病死率均居恶性肿瘤的首位[1],腺癌是肺癌的主要病理类型之一,近年来发病率呈上升趋势[2]。研究表明,从传统中药姜黄中提取的姜黄素,对乳腺癌、肺癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌等恶性肿瘤有较好的疗效,且没有明显的毒副作用,但由于口服给药生物利用度低,限制了其临床应用[3, 4]。姜黄素纳米粒可以增加姜黄素的水溶性,增加其稳定性,进而提高其生物利用度[5, 6]。本研究采用我们新近研制成功、稳定性好的一种新型姜黄素纳米粒(curcumin nanoparticles,Cur-NPs),体外考察其对Lewis肺癌细胞LLC增殖、凋亡的影响,并与游离姜黄素(curcumin,Cur)进行对比,旨在考察Cur-NPs是否能增强Cur对Lewis肺癌细胞增殖的抑制作用。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂
姜黄素购自美国Sigma公司,新型姜黄素纳米粒按我们前期研究的方法自制[6];DMEM、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司;MTT、propidium iodide (PI)、RNase A、细胞凋亡试剂盒Annexin V FITC-PI、钙离子检测探针Fluo-3、活性氧检测探针DCFH、线粒体膜电位检测探针Rhodamine123(Rho123)购自碧云天生物技术研究所。流式细胞术采用美国BD FAC-SVantage 型流式细胞仪。Lewis肺癌细胞LLC细胞系由第三军医大学新桥医院全军肿瘤研究所馈赠。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养
LLC细胞用含有10%新生胎牛血清(FBS)及0.5%青链霉素的DMEM培养基,在37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱培养,取处于生长对数期的细胞进行实验。 1.2.2 MTT法检测姜黄素纳米粒对LLC细胞增殖的影响
取对数期细胞,接种于96孔板中,每孔接种5 000个/100 μL,培养12 h细胞贴壁后,再加入等体积含不同浓度药物的完全培养基。设阴性对照组 (Ct组)、游离姜黄素组(Cur组)、新型姜黄素纳米粒组(Cur-NPs组)和纳米粒空白载体组(NPs组),每组设 3个复孔。药物终浓度设置为2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L 和40.0 μmol/L。培养24 h,每孔加入MTT 20 μL,继续培养4 h,彻底弃去上清液后,每孔加入DMSO 150 μL,振荡器充分振荡后,用酶标仪测定各孔在490 nm处的光密度D(490)值,按以下公式计 算细胞抑制率:细胞抑制率=[1-药物组D(490)/ 阴性对照组D(490)]×100%。实验重复3次。 1.2.3 细胞周期检测
将对数期细胞接种于6孔板,细胞贴壁后,用20 μmol/L的游离姜黄素、新型姜黄素纳米粒和纳米粒空白载体处理细胞。作用24 h后,胰酶消化并取细胞悬液移入离心管中离心,吸去上清液,洗涤2~3次,加入70%冷乙醇4 ℃固定细胞24 h,加入碘化丙啶(PI)、RNase,37 ℃孵育30 min后在流式细胞仪上测定细胞周期。 1.2.4 细胞凋亡检测
将对数期细胞接种于6孔板,细胞贴壁后,用20 μmol/L的游离姜黄素、新型姜黄素纳米粒和纳米粒空白载体处理细胞。作用24 h后,胰酶消化并取细胞悬液移入离心管中离心,吸去上清液,洗涤2~3次,加入Annexin V-FITC、PI染液,染色5 min后上机检测凋亡率。 1.2.5 细胞活性氧检测
将对数期细胞接种于6孔板,细胞贴壁后,用20 μmol/L的游离姜黄素、新型姜黄素纳米粒和纳米粒空白载体处理细胞。作用24 h后,去除细胞培养液,加入DCFH-DA染液,37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次,在流式细胞仪上检测荧光强度变化。 1.2.6 细胞内钙离子浓度检测
将对数期细胞接种于6孔板,细胞贴壁后,用20 μmol/L的游离姜黄素、新型姜黄素纳米粒和纳米粒空白载体处理细胞。作用24 h后,胰酶消化并取细胞悬液移入离心管中离心,吸去上清液,洗涤2~3次,加入Fluo-3荧光探针,染色30 min后在流式细胞仪上检测荧光强度变化。 1.2.7 细胞线粒体膜电位检测
将对数期细胞接种于6孔板,细胞贴壁后,用20 μmol/L的游离姜黄素、新型姜黄素纳米粒和纳米粒空白载体处理细胞。作用24 h后,胰酶消化并取细胞悬液移入离心管中离心,吸去上清液,洗涤2~3次,加入Rhodamine123荧光探针,染色30 min后在流式细胞仪上检测荧光强度变化。 1.3 统计学分析
采用SPSS 13.0统计软件,结果以x±s表示,计量资料行student’s t检验。 2 结果 2.1 姜黄素纳米粒对LLC细胞增殖的影响
随着姜黄素浓度增加,细胞生长抑制率增加,在相同浓度下,姜黄素纳米粒提高了姜黄素对LLC细胞增殖的抑制率,空白载体对LLC细胞的增殖无明显影响。姜黄素对LLC细胞24 h的IC50为34.91 μmol/L,姜黄素纳米粒对LLC细胞24 h的IC50为10.65 μmol/L,差异有统计学意义(P<0.05,图 1)。
2.2 姜黄素纳米粒对LLC细胞凋亡的影响与对照组比较,姜黄素可以诱导LLC细胞凋亡,姜黄素纳米粒可以提高其诱导凋亡的能力。20 μmol/L的药物作用LLC细胞24 h后,各组凋亡率分别为Ct组(4.94±0.81)%、NPs组(3.32±0.52)%、Cur组(7.43±1.13)%和Cur-NPs组(67.69±9.86)%。Cur-NPs组与Cur组比较,差异有统计学意义(P<0.05,图 2)。
2.3 姜黄素纳米粒对LLC细胞周期的影响与对照组比较,姜黄素可以阻滞LLC细胞周期于S期,姜黄素纳米粒可以提高其阻滞能力。20 μmol/L的药物作用LLC细胞24 h后,各组S期比例分别为Ct组(43.67±8.92)%、NPs组(64.43±10.12)%、Cur组(81.57±9.15)%和Cur-NPs组(92.20±7.65)%。Cur-NPs组与Cur组比较,有统计学差异(P<0.05,图 3)。
2.4 姜黄素纳米粒对LLC细胞内活性氧的影响Ct组及NPs组荧光强度较微弱,药物处理24 h后胞内活性氧浓度增加,姜黄素纳米粒的荧光强度高于姜黄素原料药的荧光强度。20 μmol/L的药物作用LLC细胞24 h后,各组活性氧荧光强度分别为Ct组(110.76±28.31)、NPs组(127.34±31.25)、Cur组 (2 088.01±238.19)和Cur-NPs组(2 568.67±361.85)。 Cur-NPs组与Cur组比较,差异有统计学意义(P<0.05,图 4)。
2.5 姜黄素纳米粒对LLC细胞内钙离子浓度的影响Ct组及NPs组荧光强度较微弱,药物处理LLC细胞24 h后胞内钙离子浓度增加,姜黄素纳米粒的荧光强度高于姜黄素原料药的荧光强度。20 μmol/L的药物作用LLC细胞24 h后,各组钙离子荧光强度分别为Ct组(28.99±3.91)、NPs组(35.79±4.85)、Cur组(52.11±11.28)和Cur-NPs组(97.85±15.68)。Cur-NPs 组与Cur组比较,差异有统计学意义(P<0.05,图 5)。
2.6 姜黄素纳米粒对LLC细胞线粒体膜电位的影响20 μmol/L的药物作用LLC细胞24 h后,各组线粒体膜电位荧光强度分别为Ct组(228.03±38.64)、NPs组(184.34±26.84)、Cur组(128.97±18.56)和Cur-NPs组(94.00±12.11)。姜黄素作用LLC细胞24 h后细胞线粒体膜电位降低,姜黄素纳米粒的膜电位更低,两者有统计学差异(P<0.05,图 6)。
3 讨论姜黄素是一种天然提取物,研究发现其有明显的抗癌活性而没有毒副作用,具有广阔的开发前景,美国国立肿瘤所(NCI)已经将其列为第3代防癌药物进行研究[7]。但由于游离姜黄素的不稳定、口服生物利用度低等缺点,研究者们一直试图通过制剂技术来改善其不稳定性,提高其生物利用度[8]。已有学者报道了游离姜黄素对多种肿瘤细胞的抑制作用[9, 10, 11],但是姜黄素及其纳米制剂对LLC细胞增殖与凋亡的影响的报道较少。
本课题组前期通过薄膜超声法制备姜黄素纳米粒,明显增加了姜黄素的溶解性和稳定性,提高了其生物利用度[6]。进而我们采用MTT检测发现游离姜黄素和姜黄素纳米粒均可抑制LLC细胞的增殖,二者对LLC细胞24 h内的IC50分别为34.91、10.65 μmol/L,表明姜黄素纳米粒可显著提高游离姜黄素对LLC细胞的增殖抑制作用。新型姜黄素纳米粒提高了姜黄素的溶解度,相对于游离姜黄素更容易进入细胞膜,通过细胞内吞或者其他转运方式进入细胞后,释放出游离姜黄素,提高了肿瘤细胞对姜黄素的摄取,而且新型姜黄素纳米粒更稳定,不容易氧化,可以更多地进入细胞。我们研究制的这种新型姜黄素纳米粒还有缓释效果,可以延长药效作用。由于上述的原因新型姜黄素纳米粒极明显提高了姜黄素对LLC细胞的抑制增殖能力。
凋亡是抑制细胞增殖的重要原因[12],因此我们采用流仪细胞技术检测了LLC细胞的凋亡情况,结果显示,同一浓度的姜黄素、姜黄素纳米粒作用LLC细胞24 h后,Ct组、Cur组和Cur-NPs组LLC细胞的凋亡率分别为4.94%、7.43%和67.69%,提示姜黄素可以诱导LLC细胞凋亡,姜黄素纳米粒可以显著提高其诱导凋亡的能力。姜黄素可以阻滞LLC细胞周期于S期,或许是姜黄素抑制细胞增殖的重要原因之一[6],而姜黄素纳米粒可以提高其阻滞能力。
活性氧、细胞内钙离子浓度和线粒体膜电位与细胞凋亡息息相关。本研究发现空载体荧光强度较微弱,药物处理24 h后胞内活性氧浓度增加,姜黄素纳米粒的荧光强度高于游离姜黄素。经药物处理24 h后LLC细胞胞内钙离子浓度增加,姜黄素纳米粒的荧光强度高于游离姜黄素。游离姜黄素作用LLC细胞24 h后细胞线粒体膜电位降低,新型姜黄素纳米粒的膜电位更低。
综上所述,姜黄素及其新型姜黄素纳米粒对LLC细胞增殖、生长有显著的抑制作用,而这种姜黄素纳米粒可明显提高游离姜黄素的抗癌效果。游离姜黄素及新型姜黄素纳米粒均可以诱导LLC细胞凋亡和抑制其细胞周期于S期。二者诱导LLC细胞凋亡可能与其增加细胞内钙离子浓度、细胞内活性氧和降低细胞线粒体膜电位相关[13],但其机制尚不清楚,需要今后进一步研究。
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