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非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏TLR4的表达
冯新富, 范 伟, 柳 杨, 龚 毅, 侯 炬    
(550002 贵阳,贵州省人民医院肝胆外科)
关键词: 非酒精性脂肪性肝炎     TLR4     大鼠    

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是代谢综合征累及肝脏的表现。随着现代生活水平的提高,非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)的发病率增高,由其引起的肝纤维化和肝硬化发病率也有上升趋势。但因其发病机制复杂,迄今为止未找到有效的治疗药物[1, 2],探讨其发病机制是当前研究的热点问题。本研究通过观察Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)在非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织的表达,探讨其发病可能机制。 1 资料与方法 1.1 动物模型建立

20只雄性SD大鼠由军事医学科学院实验动物中心提供,体质量140~160 g。分为正常饮食组(对照组,饲料中碳水化合物、脂肪、蛋白质分别占65.5%、10.3%、24.2%)、高脂饮食组[3](模型组,饲料中88%普通饲料+10%猪油+2%胆固醇,碳水化合物、脂肪、蛋白质分别占总热量的53.0%、27.4%、19.6%),每组10只。模型组给予高脂饲料喂养16周诱发脂肪性肝炎,大鼠自由饮水和进食,分笼(每笼5只)饲养于(20±2)℃明暗各12 h的动物实验室内。于16周给大鼠腹腔注射水合氯醛3 mL/kg,从下腔静脉采血后处死。 1.2 肝组织标本的制备和观察

用多聚甲醛固定肝组织后,制备石蜡切片,HE染色,光学显微镜下观察肝细胞脂肪变性程度、炎症活动度团。根据肝细胞脂肪变性占所获肝组织标本量的范围分为4度(F0~F4):肝细胞脂肪变性<5%为F0;肝细胞脂肪变性在5%~30%为F1;肝细胞脂肪变性在>30%~50%为F2;肝细胞脂肪变性在>50%~75%为F3;肝细胞脂肪变性>75%为F4。所有切片由有经验的病理科医师进行评分,每张切片选取8个高倍视野。 1.3 TLR4 mRNA表达检测

所用PCR引物由威斯腾生物技术公司合成。Taq酶、DNaseⅠ(RNase free)购自TaKaRa公司,RNA提取试剂Tripure reagent购自Roche公司,M-Mulv Reverse Transcriptase购自Promega公司,其余均为国产分析纯试剂。

分别快速取肝脏组织、每组样品的组织约25 mg,按说明书操作提取RNA后。所用引物TLR4:上游5′-TCTGCCCTGCCACCATTTACA-3′,下游5′-CAGGTCT-AAAGAGAGATTGAC-3′,长度697 bp;β-actin:5′-CAC-CCGCGAGTACAACCTTC-3′,5′-CCCATACCCACCATC-ACACC-3′,长度207 bp;PCR反应条件94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 50 s,35个循环; 72 ℃延伸 10 min; 4 ℃保存。PCR反应条件94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。标准是TaKaRa的DL2000,取PCR扩增产物8 μL,在1.0%琼脂糖上进行凝胶电泳。应用凝胶成像系统摄取各样品电泳图。

按酶联免疫吸附(ELISA) 试剂盒说明检测大鼠肝脏组织 TLR4浓度。采用全自动生物化学分析仪检测血清ALT、AST水平,采用放射免疫分析法检测血清TNF-α水平。 1.4 统计学方法

数据以x±s表示,采用 SPSS 11.5统计软件,行单因素方差分析,SNK(q检验)进行两两比较。 2 结果

模型组大鼠造模均成功,根据肝细胞脂肪变性占所获肝组织标本量的范围分为4度(F0~F4),其中模型组大鼠肝细胞脂肪变性程度达F3、F4的分别有2、8只。模型组的TLR4 mRNA的表达明显高于对照组(图 1)。对照组血清ALT [(38.21±8.90) U/L]、AST [(147.23±42.03) U/L]、TNF-α[(1.32±0.63)μg/L]、 TLR4[(10.24±1.01) ng/mL]浓度明显低于模型组[分别为 (109.32±18.50)U/L、(257.35±56.10)U/L、(3.62±0.93)μg/L、(43.45±6.57)ng/mL ,P<0.05]。

M:标准(DL2000);1~6:对照组;7~12:模型组 图 1 不同组别肝脏TLR4 mRNA的表达情况
3 讨论

TLR4是新近才发现的脂多糖受体,被脂多糖激活后,可以通过其胞内Toll/IL-1R(TIR)结构域招募一系列信号分子,活化NF-κB,引起以TNF-α等促炎因子为核心的炎症因子级联反应,形成第二次打击[4]。已发现Toll样家族成员有10余种,其中TLR2和TLR4为主要成员,TLR4介导细菌内毒素所致的炎症反应,TLR2介导细菌外毒素所致的炎症反应。在其信号通路中TNF-α起至关重要的作用,高浓度的TNF-α可减少外周组织脂肪分解,并促进肝细胞甘油三酯的合成和聚集,而富余脂质尤其是甘油三酯在肝脏的沉积是NAFLD形成发展的先决条件。血清中TNF-α与血清内毒素水平升高呈显著正相关[5]

本研究结果显示,经过持续16周的高脂饮食喂养,大鼠体质量、肝指数明显升高,病理形态形成NASH,对照组血清ALT、AST、TNF-α、TLR4明显低于模型组。

综上所述,TRL4介导的炎症反应可能是导致大鼠非酒精性脂肪性肝炎、肝功能损伤的原因之一。

参考文献
[1] 周汝霞, 陈瑛, 李莉. 脂肪肝治疗研究进展[J]. 医药导报. 2003, 22(9): 609-610.
[2] 钟岚, 范建高, 王国良, 等. 肥胖、高脂血症性脂肪性肝炎模型的建立[J]. 实验动物科学与管理, 2000, 17(2): 16-20.
[3] 刘庆生, 陈芝芸, 严茂样, 等. 金仁方对非酒精性脂肪肝大鼠作用的实验研究[J]. 中医药学刊, 2006, 24(7): 1242-1244.
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[5] Wigg A J, Roberts-Thomson I C, Dymock R B, et al. The role of small intestinal bacterial overgrowth, intestinal permeability, endotoxaemia, and tumour necrosis factor alpha in the pathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis[J]. Gut, 2001, 48(2): 206-211.
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201408079
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

冯新富,范 伟,柳 杨,龚 毅,侯 炬.
非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏TLR4的表达
第三军医大学学报, 2015, 37(02): 100-,115.
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201408079

文章历史

收稿:2014-08-05
修回:2014-10-09

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