糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DC)是一种独立的糖尿病心血管并发症，其发病机制十分复杂，至今仍未完全阐明^[1]，有研究报道其发生、发展与心肌纤维化密切相关。目前研究认为糖尿病时高血糖可通过多种途径激活机体的炎症反应是导致糖尿病心肌纤维化的主要原因^{[2, 3]}。TNF-α是参与炎症反应的重要炎症因子，而NF-κB是细胞内参与炎症反应调控的一种重要的核转录因子，并参与了众多免疫和炎症反应有关的炎症性细胞因子，包括TNF-α的转录和表达^[4]。

硫化氢(H₂S)作为一种新发现的第3种气体信号分子，已有研究发现其在心血管疾病中具有重要的保护作用。而H₂S是否参与糖尿病心肌纤维化以及内在调控机制，目前仍不清楚^{[5, 6, 7, 8]}。本实验拟通过建立糖尿病大鼠模型，观察气体信号分子H₂S对糖尿病大鼠心肌纤维化以及TNF-α和NF-κB p65表达的影响。 1 材料与方法 1.1 实验动物

30只成年雄性SD大鼠(体质量280~320 g)，购自南华大学实验动物中心；动物饲养于恒温(23±1)℃的环境中，白天黑夜各12 h；实验动物均可自由获得水和食物。 1.2 主要实验试剂

硫氢化钠(H₂S供体)购于美国Sigma公司；兔源NF-κB p65和TNF-α一抗、兔源Ⅳ型胶原蛋白购于中国博士德公司；抗兔二抗购于美国Proteintech公司；BCA蛋白定量试剂盒、细胞裂解液购于碧云天公司。 1.3 实验分组及糖尿病模型建立

先饲养SD大鼠1周，让其适应环境；将SD大鼠分为3组：对照组(Control组)、糖尿病大鼠组(STZ组)、硫化氢干预糖尿病大鼠组(STZ+H₂S组)，每组10只。STZ组与STZ+H₂S组大鼠按体质量(40 mg/kg)腹腔注射STZ。注射后的24 h，为防止大鼠发生低血糖休克，给予5%的葡萄糖水；注射72 h后，尾静脉采血测血糖，血糖＞16.7 mmol/L提示造模成功。造模成功后，STZ+H₂S组每天腹腔注射以PBS为溶剂的NaHS溶液(100 μmol/kg)；Control组和STZ组每天腹腔注射等量的生理盐水，持续8周。 1.4 HE染色观察心肌病理学改变

取3组大鼠左心室心肌组织，多聚甲醛固定24 h后，常规石蜡包埋、切片，HE染色观察。 1.5 Western blot检测Ⅳ型胶原蛋白的表达

取3组新鲜大鼠左心室心肌组织，提取蛋白并定量。提取蛋白以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，湿转法将目的蛋白转至PVDF膜。用TBST配制的5％BSA封闭2 h后，Ⅳ型胶原一抗和GAPDH一抗(稀释度均为1 ∶400)37 ℃孵育1 h后4 ℃过夜，洗膜后用HRP标记的二抗(稀释度为1 ∶4 000)37 ℃孵育1 h，洗膜后以ECL显色，曝光后扫描，用Image J图像分析软件进行光密度分析。以GAPDH为内参。 1.6 Western blot检测NF-κB p65和TNF-α蛋白的表达

取3组新鲜大鼠左室心肌组织，提取蛋白，采用BCA比色法进行蛋白定量；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，湿转法蛋白转膜至PVDF膜。用TBST配制的5％BSA封闭2 h，封闭TNF-α、NF-κB p65和GAPDH一抗(稀释度均为1 ∶400)，37 ℃孵育1 h后4 ℃过夜，用TBST洗膜；用HRP标记的二抗(稀释度为1 ∶2 000) 37 ℃ 孵育1 h，洗涤和显影后行灰度扫描，以目的条带与GAPDH的灰度比值分别表示NF-κB p65和 TNF-α的蛋白表达水平。 1.7 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件，计量资料以x±s表示，各组间比较行单因素方差分析法。 2 结果

整个实验过程中有3只大鼠死亡，其中STZ组1只，STZ+H₂S组2只，死亡原因可能是血糖过高或者其他糖尿病并发症。 2.1 3组大鼠病理变化的观察

Control组大鼠心肌纤维排列整齐，纤维结构清晰，细胞间隙正常；STZ组大鼠心肌纤维排列紊乱、松散，心肌细胞间隙增宽，心肌细胞间可见呈堆积状分布的胶原纤维；STZ+H₂S组间质纤维化有明显改善，心肌细胞排列趋于整齐，间质有少量疏松结缔组织，且较STZ组明显减少(图 1)。

A：Control组；B：STZ组；C：STZ+H2S组 图 1 3组大鼠心肌组织病理形态学改变(HE ×400)

图选项

Western blot检测3组大鼠Ⅳ型胶原纤维表达，结果显示，与Control组比较，STZ组大鼠心肌组织Ⅳ型胶原表达明显升高(P<0.05)，STZ+H₂S组大鼠心肌Ⅳ型胶原表达与STZ组比较明显减少(P<0.05)。与Control组相比，STZ+H₂S组Ⅳ型胶原表达无明显差异(P>0.05，图 2，表 1)。

1: Control组；2: STZ组; 3：STZ+H2S组 图 2 Western blot检测硫化氢对Ⅳ型胶原蛋白表达的影响

图选项

Western blot检测结果显示，与Control组相比，STZ组大鼠心肌组织中NF-κB p65和TNF-α蛋白表达水平均明显上调(P<0.05)；而与STZ组相比，STZ+H₂S组大鼠心肌组织NF-κB p65和TNF-α表达水平均明显下降(P<0.05)。STZ+H₂S组与Control组相比，心肌NF-κB p65和TNF-α表达水平无明显改变(P>0.05，图 3，表 1)。

1: Control组；2: STZ组; 3：STZ+H2S组 图 3 Western blot检测检测H2S对NF-κB p65(A)和TNF-α(B)蛋白表达的影响

图选项

DC是一种特异性心肌病，是排除了高血压、冠心病及其他已知疾病所致的心肌损伤而独立存在的病理状态，其病理表现为心肌细胞肥大、凋亡以及心肌间质纤维化等。有研究显示，高血糖等导致的炎症反应在糖尿病心肌纤维化过程中具有重要作用，高血糖诱导的促炎细胞因子对心肌纤维化的启动和进展起着十分重要的作用^{[9, 10]}。

而TNF-α是其中重要的促炎细胞因子，作为激活细胞级联反应的主要介质，在细胞因子网络中发挥关键作用。TNF-α可通过促进心脏成纤维细胞增殖、增强基质金属蛋白酶活性、诱导氧化应激、诱导心肌细胞凋亡和调节细胞外基质的合成等多种途径参与心肌纤维化的发生和发展。NF-κB是调控多种基因转录的关键因子，活化后能调控包括TNF-α在内的多种炎症介质的转录。NF-κB作为炎性反应的整合者，在免疫调节和炎症发生过程中具有重要作用。NF-κB是炎症反应链的“基因开关”，它参与许多细胞因子的表达调控^[11]。激活的NF-κB可启动下游基因的转录，导致包括TNF-α在内的炎症因子的过度表达^[12]。而TNF-α基因启动子区也含有NF-κB结合位点，炎症反应时包括TNF-α可激活NF-κB，并可转入核内进一步调控包括TNF-α在内细胞因子多种基因转录。如此循环，导致级联放大作用^[13]。糖尿病时晚期糖化终产物、蛋白质的非酶糖化和氧化应激产生的活性氧和活性氮以及其特异性受体结合等也都可以激活NF-κB。本研究结果显示，糖尿病大鼠心肌存在明显心肌纤维化，Ⅳ型胶原蛋白的表达也明显增加，而同时心肌组织中TNF-α和NF-κB p65的蛋白表达也明显上调，提示糖尿病大鼠心肌纤维化与NF-κB/TNF-α通路的激活有关。

而H₂S是继NO和CO后的新发现的第3种内源性气体信号分子^{[14, 15]}。内源性H₂S具有舒张血管平滑肌、降低血压、抑制心肌细胞凋亡、抑制血管平滑肌细胞增殖等多种生物学效应^[14]。本实验结果显示，糖尿病大鼠存在明显的心肌纤维化，而H₂S干预后，糖尿病大鼠心肌纤维化程度明显减轻，且Ⅳ型胶原表达明显减少，提示H₂S作为信号分子可能参与糖尿病心肌病的发生、发展过程，而H₂S的干预可改善糖尿病大鼠心肌纤维化，但H₂S改善心肌病变的机制尚不完全清楚。本研究表明，H₂S改善糖尿病大鼠心肌纤维化的同时，心肌组织中TNF-α、NF-κB p65蛋白的表达也显著下降，提示H₂S可能通过抑制炎症反应和NF-κB/TNF-α信号通路而改善糖尿病大鼠心肌纤维化。而在其他学者的研究中也发现H₂S可通过NF-κB p65抑制TNF-α导致的炎症反应^[16]。而H₂S通过NF-κB/TNF-α信号通路改善糖尿病心肌纤维化的具体信号机制和临床意义仍有待深入研究。