Sulfiredoxin-1 (Srxn1)是真核生物中通过进化选择的内源性小分子蛋白之一。近年来,人们发现Srxn1依靠其良好的抗氧化、抗凋亡作用在促进神经细胞存活方面发挥重要功能。本课题组前期的研究也证实,Srxn1能够保护PC12细胞免受H2O2诱导的氧化应激损伤,且这种保护作用与Peroxiredoxins (Prdxs)家族的活性有关[1]。新近报道发现,Srxn1参与了LPS/γ-IFN 刺激下的小鼠原代巨噬细胞的免疫防御作用,减少细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生[2]。进一步基因功能研究发现,Srxn1表达缺失可以加快一些重要的炎症反应因子的激活,引起细胞的损伤[3]。因此,Srxn1 有可能作为机体氧化应激和固有免疫交叉反应的核心作用因子,影响脑缺血再灌注后期的炎症反应,其具体的神经保护机制还需要进一步阐明。
目前,星形胶质在脑缺血再灌注炎症反应中的地位日渐重视,有可能在脑卒中时神经元、小胶质细胞的炎症反应中起到重要的调控作用[4, 5]。并且,与神经元相比较,Srxn1在星形胶质细胞中的诱导水平较高[2, 6]。因此,本研究通过H2O2处理、氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation followed by recovery,OGD/R)模型,模拟体内脑缺血再灌注损伤,通过慢病毒载体干扰Srxn1的表达,观察Srxn1对大鼠星形胶质细胞缺血损伤的保护作用,进一步阐明Srxn1的神经保护机制。 1 材料与方法 1.1 大鼠原代星形胶质细胞培养
取清洁级出生1~2 d的健康SD乳大鼠共120只,雌雄不拘,由重庆医科大学实验动物中心提供。参照Park等[7]报道的步骤,分离双侧大脑皮质,用胰酶消化成单个细胞,用含10%血清的DMEM/F12(Gibco公司)作为细胞培养液,通过差速贴壁、震荡、传代的方法去除神经元及小胶质细胞,得到纯度较高的星形胶质细胞。通过形态学、免疫细胞化学(胶质细胞纤维酸性蛋白GFAP染色),鉴定得到纯化率约为95%的大鼠原代星形胶质细胞用于后续实验。 1.2 Srxn1基因干扰
将大鼠原代星形胶质细胞分为未处理(Normal)组、阴性对照(Control)组和2组Srxn1基因干扰组(Lenti-Srxn1-sh1组和Lenti-Srxn1-sh2组),分别使用上海吉玛制药技术有限公司设计包装的慢病毒载体,将阴性对照和Srxn1-shRNA转染入星形胶质细胞。Control组序列为:5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′,Lenti-Srxn1-sh1组干扰序列为:5′-CGTGCCAATCGCCGTGCTCAT-3′,Lenti-Srxn1-sh2组干扰序列为:5′-CATCCACACCAGACTTGCAGT-3′。操作步骤按说明书进行,转染72 h后,检测转染率及后续实验。 1.3 H2O2模型的建立
参照我们课题组前期报道的方法建立H2O2模型[1]:将Sigma公司购得的H2O2配制成工作液加入各组细胞的培养液中,使得H2O2的最终浓度为100 μmol/L,并移入37℃、5%CO2孵箱,培养6 h后进行后续实验。 1.4 氧糖剥夺/复氧模型(OGD/R)的建立
参照本课题组前期报道的方法建立OGD/R模型[8]:用无糖DMEM培养液(Gibco公司)洗涤2遍后,将培养基更换为无糖DMEM,快速放入Forma model 3131三气培养箱(94%N2、1%O2、5%CO2,37 ℃),6 h后换回原来培养基,放入37 ℃、5%CO2孵箱继续培养24 h模拟再灌注损伤。 1.5 MTT法检测细胞存活率
用96孔板培养细胞,加入MTT(Sigma公司),20 μL/孔,放入37 ℃孵箱继续培养,4 h后小心吸弃 各孔内的培养液,加入150 μL DMSO,振荡15 min,用酶标仪在490 nm波长处检测各孔光密度值[D(490)]。 1.6 双荧光免疫细胞化学法检测NF-κB入核情况
将接种培养在爬片上的细胞用预冷4%多聚甲醛固定20 min ,0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次;滴加封闭血清,37 ℃孵育20 min,倾去血清,滴加一抗NF-κB p65(1 ∶50,Bioworld公司),4 ℃湿盒过夜,0.01 mol/L PBS漂洗10 min×3次。红色荧光二抗 (1 ∶200),37 ℃孵育20 min,避光。滴加DAPI(碧云天公司),标记所有细胞核,室温孵育30 min,0.01 mol/L PBS漂洗10 min×3次。甘油封片,荧光显微镜下观察。 1.7 Western blot 检测Srxn1、p-NFκB p65、巨噬细胞游走抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)的蛋白表达
细胞裂解液提取各组蛋白,用Bradiford法测定蛋白浓度。采用Western blot标准步骤进行电泳、转膜、封闭。一抗稀释浓度分别为:anti-Srxn1(1 ∶400,Proteintech公司);p-NFκB p65(1 ∶500,Bioworld公司);MIF(1 ∶500,Bioworld公司)。用Quantity One 软件测定条带的灰度值,以β-actin 灰度值作为内参照,以目的条带与内参条带的光密度比值表示蛋白表达量。 1.8 统计学分析
实验数据以x±s表示,采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析。 2 结果 2.1 Srxn1干扰效率的检测
Western blot结果显示,在正常情况下(未进行 H2O2和OGD/R处理),与慢病毒Control组比较,Lenti- Srxn1-sh1组和Lenti-Srxn1-sh2组Srxn1的表达明显降 低(P<0.01,P<0.05,图 1A、B)。用100 μmol/L H2O2 处理6 h后,与慢病毒Control组比较,Lenti-Srxn1-sh1组和Lenti-Srxn1-sh2组Srxn1蛋白水平均明显降低(P<0.01)。同样,在OGD/R模型中,与慢病毒Control 组相比较,Lenti-Srxn1-sh1组和Lenti-Srxn1-sh2组Srxn1/β-actin比值也分别减少至0.33±0.01和0.42±0.04(P<0.01,图 1C、D)。表明Lenti-Srxn1-sh1和Lenti-Srxn1-sh2两组干扰片段均可以明显减少Srxn1的表达。
2.2 Srxn1干扰降低细胞存活率MTT结果显示,用H2O2和OGD/R两种模型,均可以导致大鼠原代星形胶质细胞明显损伤。与Control组比较,两种Srxn1基因干扰组 (Lenti-Srxn1-sh1组和 Lenti-Srxn1-sh2组)均可以明显减少细胞存活率(图 2)。
2.3 Srxn1干扰增加NF-κB p65入核双荧光免疫细胞化学结果显示,NF-κB p65标记为红色荧光;DAPI标记细胞核,为蓝色荧光;如果两者共同表达,则为紫色荧光。在正常情况下,与慢病毒Control组比较,Lenti-Srxn1-sh1组和Lenti-Srxn1-sh2组可以增加NF-κB p65红色荧光在细胞核内的表达。在H2O2处理时,Control组中红色荧光表达较强,但是主要位于细胞胞浆区,仅有部分进入蓝色细胞核区域;Lenti-Srxn1-sh1组和Lenti-Srxn1-sh2组,红色荧光较多地进入蓝色细胞核区域,merge后使细胞核区域显示紫色荧光。同样,OGD/R处理时,双荧光免疫细胞化学结果与H2O2处理后基本一致(图 3)。
2.4 Srxn1干扰增加p-NFκB p65的表达Western blot检测结果显示:在正常情况下,与慢病毒Control组比较,Lenti-Srxn1-sh1组和Lenti-Srxn1-sh2组可以增加p-NFκB p65蛋白的表达(P<0.05,图 4A、B)。100 μmol/L H2O2处理星形胶质细胞6 h后,Lenti-Srxn1-sh1组p-NFκB p65的表达大约是Control组的1.89倍,Lenti-Srxn1-sh2组的表达大约是Control组的1.56倍。OGD/R处理24 h也得到类似的结果,与Control组比较,Lenti-Srxn1-sh1组和Lenti-Srxn1-sh2组p-NFκB p65的表达均明显增加(P<0.01,图 4D、E)。
2.5 Srxn1干扰增加MIF的表达Western blot检测结果显示:在正常情况下,与慢病毒Control组比较,Lenti-Srxn1-sh1组和Lenti-Srxn1-sh2组可以增加MIF的表达(P<0.05),Lenti-Srxn1-sh1组MIF的表达大约是Control组MIF的1.41倍,Lenti-Srxn1-sh2组MIF的表达大约是Control组MIF的1.47倍(图 4A、C)。分别用H2O2和OGD/R两种模型处理大鼠原代星形胶质细胞后,Srxn1干扰组MIF蛋白表达水平均高于Control组,差异具有统计学意义(P<0.01,图 4D、F)。 3 讨论
在脑缺血再灌注后期,由于自由基刺激细胞因子和黏附分子的表达,介导炎症和免疫反应,加重脑组织再灌注损伤。研究表明,一些小分子蛋白有可能在脑组织的该炎症反应过程中发挥重要作用[9]。Srxn1,是机体中具有神经保护作用的重要内源性小分子蛋白之一,既往对其的功能及机制研究大多都局限在其抗氧化及抗凋亡的作用上面[1, 6],目前,对Srxn1在脑缺血炎性损伤方面的功能及机制尚不清楚。在课题组前期研究的基础之上,本研究以大鼠原代星形胶质细胞为研究对象,采用经典的H2O2、OGD/R模型,模拟体内脑缺血再灌注损伤,通过两组慢病毒干扰片段降低Srxn1的表达,结果显示,在H2O2和OGD/R模型中,干扰Srxn1基因均能够使细胞存活率明显下降,提示抑制Srxn1的表达,能够加重H2O2和OGD/R处理后星形胶质细胞的损伤。
在星形胶质细胞中,Srxn1是否参与活化NF-κB炎症通路及下游靶基因,目前尚不清楚。核转录因子 NF-κB的过度活化(包括NF-κB p65入核表达及p-NFκB p65水平增加)是NF-κB信号通路激活的关键[10, 11]。本研究双标免疫细胞化学结果提示,用100 μmol/L H2O2 处理后,Lenti-Srxn1-sh1组和Lenti-Srxn1-sh2组均可见标记NF-κB p65的红色荧光抗体由细胞胞浆区域大量进入蓝色的细胞核区域。在OGD/R模型中也得到了相同的结果。Western blot结果显示,在蛋白水平上,Srxn1干扰组能够使细胞p-NFκB p65的表达增高,以上结果均证实干扰Srxn1基因能够诱导NF-κB的活化。
NF-κB活化后,MIF表达升高,从而可以诱导下游一系列炎症因子的释放[12, 13]。我们课题组前期报道发现,NF-κB/MIF通路在大鼠脑缺血再灌注炎症损伤起到重要作用,是中药丹参酮ⅡA发挥神经保护作用的重要信号转导途径之一[14]。本研究Western blot结果显示,在两种细胞损伤模型(H2O2、OGD/R模型)中,Srxn1干扰组NF-κB靶基因MIF蛋白表达水平均高于对照组。以上结果提示,干扰Srxn1基因能使NF-κB 及其下游信号分子的表达升高。
综上所述,Srxn1作为体内重要的神经保护因子,可以减少H2O2、OGD/R对大鼠星形胶质细胞的损伤,并且这种保护功能可能与其对细胞重要的核转录因子NF-κB及下游信号通路的激活密切相关。
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