食管癌在恶性肿瘤中的发病率居第6位,在河南等地区有着更高的发病率[1, 2]。食管癌在组织病理学及遗传学上是一个异质性疾病,依据传统的组织病理学分类很难推测其预后。食管癌的发生是一个多因素、多步骤的过程,在食管癌的不同进展阶段,均涉及癌基因的激活以及肿瘤抑制基因的失活。癌基因的激活以及肿瘤抑制基因的失活的连续增益为实体瘤的逐步发展提供了必要基础,包括恶性肿瘤形成、发展、浸润及转移[3]。最近,一些新的与食管癌相关的癌基因和抑癌基因已被确定,可能在临床上对食管癌的早期诊断和有效的治疗以及推测预后有重要意义。
锌-α2-糖蛋白(Zn-alpha2-glycoprotein,AZGP1)基因位于染色体7q22,编码是一种41×103的可溶性糖蛋白,其蛋白质由299个氨基酸组成,包括4个外显子和3个内含子[4]。近年研究表明,AZGP1参与了多种肿瘤的发生和分化,在前列腺癌及乳腺癌,其表达水平与肿瘤的分化程度密切相关[5]。并且,AZGP1是前列腺癌的一个潜在的血清标志物[6]。研究显示,AZGP1在前列腺癌、胰腺癌和其他一些恶性肿瘤中具有肿瘤抑制功能[7, 8]。然而AZGP1在食管鳞癌中的作用尚未被评估。本研究通过免疫组织化学法检测食管鳞癌组织及癌旁正常食管黏膜中AZGP1蛋白表达,分析 AZGP1蛋白表达与临床病理特征之间的关系,并评估AZGP1蛋白表达对食管鳞癌患者的预后价值。 1 对象与方法 1.1 对象
收集2008年1月至2010年6月在河南省南阳市第一人民医院行手术切除的食管鳞癌标本112例,均经病理学确诊。所有病例无糖尿病、类风湿、甲状腺功能亢进等其他疾病,术前未接受化疗、放疗以及生物免疫治疗。术后开始随访,截止日期为2014年4月30日。生存时间以月为单位,计算自手术之日至肿瘤进展的时间为无进展生存期(progression-free survival,PFS),自手术之日至死亡或最后随访时间为总生存期 (overall survivaL,OS)。其中男性73例,女性39例,年龄45~76岁,中位年龄60岁,≥60岁49例,<60岁 63例;低分化46例,高-中分化66例;行根治术100例,未行根治术12例;有淋巴结转移60例,淋巴结转移阴性52例;按国际抗癌联盟(international union against cancer,UICC) 第7版TNM 分期标准,Ⅰ期22 例、Ⅱ 期26例、Ⅲ 期54例、Ⅳ 期10例。 1.2 方法
将石蜡包埋的食管鳞癌组织行4 μm连续切片,备免疫组织化学法检测。兔抗人AZGP1多克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司,二步法抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒购自丹麦DAKO公司,非免疫山羊血清、苏木精等购自北京中杉金桥生物技术公司。操作步骤参照试剂盒说明书进行。以非免疫兔或小鼠的IgG代替特异性一抗作为阴性对照,以已知的阳性表达组织切片作为阳性对照。 1.3 免疫组化结果的评判
在光学显微镜下观察免疫组织化学切片,评价AZGP1蛋白在食管鳞癌组织及癌旁正常食管黏膜中表达水平。实验结果采用半定量评分标准评估。根据AZGP1蛋白染色强度(不着色为阴性0分,着淡黄色为弱阳性1分,着棕黄色为阳性2分,着棕褐色或出现粗大棕褐色颗粒为强阳性3分)和阳性染色细胞百分率(1%~10%为1分;10%~50%为2分;>50%~75%为3分;75%阳性以上为4分)评分,两者评分相加所得半定量值为染色指数,<4分评判为AZGP1表达水平降低。 1.4 统计学分析
采用SPSS 17.0统计学软件,比较2组计数资料之间的差别用χ2检验,采用Kaplan-Meier法计算生存率及描绘生存曲线。 2 结果 2.1 食管鳞癌组织及癌旁正常食管黏膜中AZGP1蛋白的表达
AZGP1蛋白主要表达在食管鳞癌组织及癌旁正 常食管黏膜组织的细胞膜和细胞质中(图 1)。在112例 食管鳞癌组织中AZGP1蛋白高表达53例,低表达59例;在25例癌旁正常食管黏膜中AZGP1蛋白高表达19例,低表达6例;AZGP1蛋白在食管鳞癌组织及癌旁正常食管黏膜中表达水平差别有统计学意义(47.3% vs 76.0%,χ2=6.741,P=0.008)。
2.2 食管鳞癌组织中AZGP1蛋白表达与临床病理特征的关系112例食管鳞癌组织中AZGP1蛋白低表达59例(52.7%),高表达53例(47.3%);AZGP1蛋白在高-中分化(62.1%)、T1~3分期(61.7%)及临床分期Ⅰ期+Ⅱ期(58.3%)食管鳞癌组织中高表达多,在低分化(60.9%)、T4分期(63.8%)及临床分期Ⅲ期+Ⅳ期(60.9%)食管鳞癌组织中低表达多,P值分别为0.014、0.008和0.033,差异有统计学意义;但AZGP1蛋白表达水平与患者的性别、年龄、是否行根治术及淋巴结是否转移等临床特征无关(表 1)。
临床病理特征 | n | AZGP1 | P值 | |
低表达 | 高表达 | |||
年龄(岁) | 0.452 | |||
<60 | 63 | 34 | 29 | |
≥60 | 49 | 25 | 24 | |
性别 | 0.508 | |||
男 | 73 | 38 | 35 | |
女 | 39 | 21 | 18 | |
分化程度 | 0.014 | |||
高分化+中分化 | 66 | 25 | 41 | |
低分化 | 46 | 28 | 18 | |
根治术 | 0.237 | |||
是 | 100 | 51 | 49 | |
否 | 12 | 8 | 4 | |
T分期 | 0.008 | |||
T1+T2+T3 | 47 | 18 | 29 | |
T4 | 65 | 41 | 24 | |
淋巴结转移 | 0.484 | |||
无 | 52 | 28 | 24 | |
有 | 60 | 31 | 29 | |
临床分期 | 0.033 | |||
Ⅰ期+Ⅱ期 | 48 | 20 | 28 | |
Ⅲ期+Ⅳ期 | 64 | 39 | 25 |
112例食管鳞癌患者中根据AZGP1蛋白表达水平分高表达组及低表达组2组,随访显示PFS为4.5~45.9个月,AZGP1蛋白低表达组中位PFS为9.6个月,AZGP1蛋白高表达组中位PFS为15.4个月,2组差异有统计学意义(χ2=12.990,P<0.01)。OS为9.0~60.1个月,AZGP1蛋白低表达组中位OS为17.4个月,AZGP1蛋白高表达组中位OS为23.8个月,2组差异有统计学意义(χ2=12.225,P<0.01,图 2)。
3 讨论食管癌的预后与肿瘤细胞的生物学特点密切相关,如肿瘤细胞生长、分化、侵袭等,而这些生物特性则由相关基因决定。研究报道正常口腔组织中AZGP1表达水平高于口腔肿瘤组织[9],本研究发现,癌旁正常食管黏膜中AZGP1蛋白表达水平高于食管鳞癌组织(P<0.05),与上述报道一致,推测AZGP1可能为抑癌基因。Descazeaud等[8]报道了AZGP1在91.1% 的良性增生腺体组织中表达,但只有在40.7%低分化肿瘤组织、48.5%高分化前列腺腺癌组织和8%转移癌组织中表达。本研究显示AZGP1蛋白在高-中分化、 T1~3分期及临床分期Ⅰ期+Ⅱ期食管鳞癌组织中高表达多,在低分化、T4分期及临床分期Ⅲ期+Ⅳ期食管鳞癌组织中低表达多(P<0.05)。可以推测AZGP1蛋白高表达的食管鳞癌患者可能恶性程度较低;而AZGP1蛋白低表达的食管鳞癌患者倾向于恶性程度高。这些结果表明AZGP1高表达可能对食管鳞癌有抑制作用。
目前AZGP1抑制肿瘤的分子机制仍不清楚。 AZGP1属于巨球蛋白家族的一个古老和进化保守的链接免疫系统。Zorin等[10]认为巨球蛋白有结合水解酶的能力,可能抑制水解酶介导的肿瘤浸润。并且在同一时间过量的巨球蛋白/水解酶复合物可以激活细胞凋亡[11]。He等[12]报道称,AZGP1可下调细胞周期蛋白依赖性激酶,它负责调节细胞周期G2~M过渡,是细胞周期中的限速步骤。这表明AZGP1间接地抑制肿瘤的进展。另外,在胰腺癌中AZGP1也被认为是 肿瘤抑制基因;Kong等[7]的研究表明,通过抑制TGF-β 介导的ERK信号,AZGP1基因可诱导间充质细胞转分化。然而,AZGP1在食管鳞癌中抑制肿瘤的分子机制需进一步研究。
Huang等[13]研究发现与AZGP1 mRNA及蛋白低表达的胃癌患者相比,高表达的胃癌患者的5年生存率及总生存率均明显增高(P<0.05)。本研究发现与AZGP1蛋白低表达的食管鳞癌患者相比,高表达的食管鳞癌患者无肿瘤进展生存时间及总生存时间均明显延长。这些结果表明,AZGP1可以作为一个新的预测食管鳞癌患者预后的生物标记物。
总之,本研究对食管鳞癌组织中AZGP1蛋白表达水平做了考察,发现AZGP1蛋白表达水平与食管鳞癌患者的临床病理特征如肿瘤分化程度、T分期及临床分期存在关系,且影响食管鳞癌患者的预后。通过检测AZGP1蛋白表达水平可推测食管鳞癌恶性程度,预测食管鳞癌患者预后,从而在治疗上及早实施干预措施。然而,AZGP1对食管鳞癌抑制作用所涉及的分子机制尚需进一步研究。
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