骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种具有很强自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，在一定的诱导条件下，其可向成骨、成肌、成脂等多种细胞分化[1, 2]，因此，在再生医学领域，MSCs一直被作为理想种子细胞用于多种组织的修复[3]，也被用于骨质疏松、难治性骨折等骨科疾病治疗的研究。本课题组构建的永生化小鼠胚胎成纤维细胞(immortalized mouse embryonic fibroblasts,iMEF)具备MSCs特征，可用于体内外MSCs相关实验中[4]。BMP9在体外可以诱导MSCs向成骨分化，是目前已经分离并鉴定的20余种BMPs中诱导MSCs成骨分化能力最强的因子[5, 6],但具体机制不清楚。Notch1是Notch信号通路受体之一，有研究表明其在MSCs成骨分化中发挥重要作用[7, 8, 9, 10]。那么在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中，Notch1扮演什么样的角色呢？本研究探讨Notch1在BMP9诱导的iMEF细胞成骨分化中的作用，以期对MSCs成骨分化的研究提供更可靠的依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株及腺病毒
永生化小鼠胚胎成纤维细胞(immortalized mouse embryonic fibroblasts,iMEF)、dnNotch 1、红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)、骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)、绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)均由芝加哥大学何通川惠赠并由本实验室保存、人结肠癌细胞株HCT116由重庆医科大学分子实验室保存。 1.1.2 主要试剂
DMEM及MEM高糖培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，小牛血清(Hyclone公司)，磷酸盐粉(中杉金桥公司)，RNA提取试剂Trizol(Invitrogen 公司)，ALP染色试剂(Sigma公司)，荧光素酶检测试剂(Promega 公司)，SYBR GreenⅠ试剂(TaKaRa公司)，引物(Invitrogen公司合成)，Western及IP细胞裂解液(碧云天公司)，牛血清粉BSA(Sigma 公司)，p-Smad1/5/8抗体(CST公司)，Smad1/5/8抗体和β-actin单抗隆抗体(Santa Cruz 公司)，羊抗鼠、羊抗兔抗体(中杉金桥公司)。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养与处理
复苏iMEF细胞培养于含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素(P/S)、DMEM高糖培养基中。HCT116细胞培养于含10%小牛血清、1%(P/S)，MEM/EBSS高糖培养基中。37 ℃、5% CO2条件下培养。待细胞贴壁生长并融合至80%左右时，用适量胰蛋白酶进行消化传代。 1.2.2 ALP活性测定与染色
将iMEF细胞接种至24孔板，按2×104/孔，待细胞融合至30%左右时，加入RFP或dnNotch1后换液，待红色荧光出现后(约36 h)，加入适当量的条件培养基，继续培养5 ~7 d进行ALP染色与ALP活性定量分析。ALP染色：吸引器 吸去培养基，每孔200～500 μL ALP染色液，避光，10～30 min后观察染色。ALP活性定量分析：吸引器吸去培养基，加入1×细胞裂解液100 μL /孔，静置5 min。 刮下细胞裂解物并收集至EP管，离心(13 000 r/min，5 min)。另一EP管中加入ALP底物与Lupo Buffer混合液(1 ∶3)20 μL。吸取5 μL裂解上清至上述EP管内，混匀，避光静置45～60 min后上机检测。 1.2.3 SBE荧光素酶检测
将iMEF细胞接种至T25中，待细胞融合至50%左右时，利用脂质体2000将SBE质粒转染入细胞内，37 ℃、5%CO2培养过夜，铺24孔板，同时加入dnNotch1和BMP9，感染率均约50%，8 h后换液，36 h后检测SBE荧光素酶活性。 1.2.4 PCR检测
培养iMEF至一定时间收集细胞，用TRIzol试剂提取细胞总RNA，通过琼脂电泳验证mRNA的质量并进行定量，取1 μg RNA逆转录为cDNA，并将cDNA置于-20 ℃保存以普通PCR和实时荧光定量PCR备用。RT-PCR:20μL体系，反应条件，95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，26～30个循环；72 ℃ 10 min。2%琼脂糖凝胶跑电泳，凝胶成像，引物见表 1。qRT-PCR:10 μL体系，反应条件，预变性94 ℃ 2 min； 92 ℃ 20 s；68 ℃ 30 s； 72 ℃ 20 s，延伸末尾采集荧光，40个循环；融解曲线荧光采集(65～99 ℃)。
| 引物 | 引物序列 | 产物长度(bp) |
| Notch1 | 上游 5′-CCTGCCACTATGGTTCCTGT-3′下游 5′-CCCTTGAGGCATAAGCAGAG-3′ | 175 |
| Notch2 | 上游 5′-CCTGAACGGGCAGTACATTT-3′下游 5′-GCGTAGCCCTTCAGACACTC-3′ | 165 |
| Notch3 | 上游 5′-CTCAACTCCAGGCTCACCTC-3′下游 5′-GGCTGAGCCAAGAGAACAAC-3′ | 165 |
| Notch4 | 上游 5′-AATGGGGGTACCTGTGTGAA-3′下游 5′-GTATAGCCAGGGCTGCAGAG-3′ | 179 |
| dnRNotch1 | 上游 5′-GCAGAACAACAAGGAGGAGACT-3′下游 5′-GAGGTCCTTAGCTTCCTTGCTAC-3′ | 361 |
| Hey 1 | 上游 5′-GGCCTGCTTGGCTTTTCT-3′下游 5′-CCAAGTGCAGGCAAGGTC-3′ | 120 |
| OPN | 上游 5′-ACACTTTCACTCCAATCGTCC-3′下游 5′-TGCCCTTTCCGTTGTTGTCC-3′ | 240 |
| OCN | 上游 5′-TCTGACAAAGCCTTCATGTCC-3′下游 5′-AAATAGTGATACCGTAGATGG-3′ | 199 |
| Runx2 | 上游 5′-GGTGAAACTCTTGCCTCGTC-3′下游 5′-AGTCCCAACTTCCTGTGCT-3′ | 243 |
| CollaⅠ | 上游 5′-CGGCTCCTGCTCCTCTTA-3′下游 5′-TTCATTGCATTGCACGTCAT-3′ | 183 |
| Id 1 | 上游 5′-ACGACATGAACGGCTGCT-3′下游 5′-CAGCTGCAGGTCCCTGAT-3′ | 122 |
| Id 2 | 上游 5′-CAGCATCCCCCAGAACAA-3′下游 5′-TCTGGTGATGCAGGCTGA-3′ | 122 |
| Id 3 | 上游 5′-CTACGAGCGGTGTGCTG-3′下游 5′-GCGCGAGTAGCAGTGGTT-3′ | 120 |
| GAPDH | 上游 5′-GGCTGCCCAGAACATCAT-3′下游 5′-ATGATGTTCTGGGCAGCC-3′ | 180 |
细胞培养待汇合至50%左右时，加入RFP和dnNotch1，感染36 h后加入GFP或BMP9条件培养基，诱导培养3 d后行结晶紫染色，吸去24孔板内培养基，PBS洗2～3遍，加入10%甲醇(400 μL/孔)，固定5 min，加入0.05%结晶紫溶液(400 μL/孔)，染色2～5 min后观察染色情况，吸去染色液终止反应，加入ddH2O洗1遍，扫描成像。 1.2.6 Western blot检测
iMEF细胞培养待细胞融合至70%左右时加入dnNotch或RFP，病毒持续感染36 h后加入BMP9条件培养基，诱导1 h后提取总蛋白。用冰PBS洗涤细胞3次，并将残余液体吸净,加0.2 mL细胞裂解液，置于冰上 5 min；用橡皮刮刮下细胞，移入离心管；4 ℃ 13 000 r/min 离心20 min，取上清至另一个EP管中，并加入50 μL的5×蛋白上样缓冲液，最后沸水浴5～10 min,分装后-20℃保存备用。配制浓缩胶和分离胶，100 V恒压电压下SDS-PAGE凝胶电泳，200 mA恒流电流转膜，依次加一抗和二抗孵育、洗膜，化学法发光底物进行显影。 1.2.7 流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡
细胞周期检测：吸去培养基，用胰酶将细胞消化下来，用冰1×PBS洗涤细胞3次，离心沉淀细胞，弃上清，用70%预冷的乙醇重悬，4 ℃存储过夜，上机检测。细胞凋亡检测：吸去培养基，用胰酶将细胞消化下来，用冰 1×PBS洗涤细胞3次，离心沉淀细胞，弃上清，上机检测。 1.3 统计学分析
采用SPSS 17.0统计软件，实验独立重复3次，数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，检验水准α=0.05。 2 结果 2.1 dnNotch1能够竞争抑制Notch1信号通路
采用qRT-PCR检测iMEF内Notch受体内源性表达情况，结果显示：Notch各受体表达并不一致，其中Notch1在4种Notch受体中表达最多，而Notch4几乎不表达(图 1)。用dnNotch1/RFP感染iMEF细胞，培养48 h后RT-PCR检测dnNotch1,结果显示：dnNotch1作用下，dnNotch1表达显著增加(图 2、3)；qRT-PCR检 测Notch信号通路靶基因Hey1，结果显示：处理组Hey 1的 表达较空白对照组显著下调(0.75±0.08 vs 1.40±0.23，P<0.05)。
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| 图 1 qRT-PCR检测iMEF细胞内源性Notch 受体表达 |
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| 图 2 腺病毒RFP和dnNotch1的感染效率(×100) |
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| 1：空白对照；2：RFP；3：dnNotch1 图 3 RT-PCR检测腺病毒dnNotch1处理后iMEF细胞内 Notch1(胞外段)的表达 |
用腺病毒RFP或dnNotch1感染iMEF细胞，感染效率约50%，待红色荧光表达后加入GFP或BMP9条件培养基，诱导分化3、5、7 d后检测ALP活性及染色变化。结果显示：dnNotch1能降低BMP9诱导的早期成骨指标ALP活性(图 4)，且呈剂量依赖性(图 5)；同时降低晚期成骨指标OCN、OPN的表达(图 6)。
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a：P<0.05 1：空白对照; 2：RFP；3：dnNotch1；4：BMP9; 5：BMP9+RFP; 6：BMP9+dnNotch1；a:P<0.05，与BMP9+dnNotch1比较 图 4 各组3、5、7 d ALP染色观察(A)及活性分析(B) |
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A：空白对照; B：dnNotch1；C：BMP9; D：BMP9+dnNotch1(L);E: BMP9+dnNotch1(M);F: BMP9+dnNotch1(H) dnNotch1 低(L)、中(M)、高(H)滴度分别为0.1、0.5、1.0 μL；A~F:ALP 染色(×100)；G：ALP活性分析 1~6：分别为空白对照、dnNotch1、BMP9、BMP9+dnNotch1(L)、 BMP9+dnNotch1(M)、BMP9+dnNotch1(H)；a: P<0.05，与BMP9比较 图 5 不同滴度dnNotch1处理后第5天ALP 染色活性检测 |
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| 1：空白对照; 2：dnNotch1； 3：BMP9; 4：BMP9+RFP; 5：BMP9+dnNotch1 图 6 RT-PCR检测各组细胞处理后第9天OPN和 OCN表达 |
Western blot检测结果显示：BMP9能够上调p-Smad1/5/8 的蛋白水平，加入dnNotch1后，抑制了BMP9诱导的p-Smad1/5/8的蛋白水平(图 7)。同时，BMP9能够增加SBE荧光素酶活性，加入dnNotch1后，抑制了BMP9诱导的SBE荧光素酶活性(图 8)。上述结果提示：阻断Notch1信号通路后可一定程度上削弱BMP9对BMP信号的激活作用。同时，PT-PCR结果发现，BMP9能够上调Runx2和Id1成骨相关靶基因，而dnNotch1抑制了这一上调作用，但对Id2和Id3影响并不明显(图 9)。
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| 1：空白对照; 2：BMP9+dnNotch1; 3：BMP9+RFP; 4：BMP9; 5：dnNotch1 图 7 Western blot检测不同处理组BMP通路smad1/5/8改变 |
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| 1：空白对照; 2：BMP9+dnNotch1; 3：BMP9+RFP; 4：BMP9; 5：dnNotch1；a：P<0.05，与BMP9+dnNotch1比较 图 8 荧光素酶检测不同处理组SBE活性改变 |
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1：空白对照; 2：BMP9+dnNotch1; 3：BMP9+RFP; 4：BMP9; 5：dnNotch1；a：P<0.05，与BMP9+dnNotch1比较 A、B ：Runx2基因；C、D：Colla Ⅰ基因；E：Id1、2、3基因 图 9 不同处理组Runx2基因、Colla Ⅰ基因和Id1、2、3基因表达 |
结晶紫染色结果显示，诱导培养3 d后，BMP9+RFP 组细胞总数多于 BMP9+dnNotch1组，说明dnNotch1一 定程度上能够抑制了BMP9诱导的促iMEF细胞增殖作用(图 10)。流式细胞仪检测dnNotch1对BMP9作用下MEF细胞周期(图 11)及凋亡(图 12)，结果显示：GFP+dnNotch1组、GFP+RFP组、BMP9+dnNotch1组、BMP9+RFP组的增殖指数(S+G2)分别为47.86%、48.32%、55.31%、66.82%，提示BMP9在早期具有一定的促MSCs增殖的作用，而dnNotch1可以抑制该作用，结晶紫染色得到相似结果；另一方面，dnNotch1对BMP9作用下的细胞凋亡并没有显著影响。
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| 图 10 结晶紫染色观察不同处理对iMEF增殖的影响 |
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| A: GFP+dnNotch1; B: GFP+RFP; C: BMP9+dnNotch1; D: BMP9+RFP 图 11 流式细胞仪检测不同处理对iMEF周期的影响 |
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| A: GFP+dnNotch1; B: GFP+RFP; C: BMP9+dnNotch1; D: BMP9+RFP 图 12 流式细胞仪检测不同处理对iMEF凋亡的影响 |
MSCs是一种来源于骨髓基质具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。因其具有取材方便，易于分离培养等优点，在细胞替代治疗、基因治疗以及组织器官再造中具有重要的临床应用价值[11, 12]。Notch信号是细胞与细胞之间直接作用的主要信号通路之一，与多种肿瘤的发生、发展密切相关，对多种细胞命运起决定性作用[13]。Notch1是Notch受体之一，属于Ⅰ型跨膜蛋白，由胞内区、跨膜区和胞外区组成[14]。研究发现，Notch1在MSCs的多向分化中发挥重要作用[15]；Hiltion等[16]研究表明显示Notch1有抑制MSCs成骨分化的作用；而Jung等[17]发现蚕丝蛋白通过抑制Notch1和其下游靶基因的表达促进MSCs成骨分化，从而促进骨折愈合；Xu等[8]证明，在缺氧的状态下，MSCs内Notch信号通路活性和Notch1表达水平增加，但MSCs的成骨分化能力减弱，而抑制Notch1的活性可以恢复缺氧条件下MSCs向成骨分化的潜能。
本课题在证实dnNotch1能竞争性抑制iMEF细胞内源性Notch1表达，降低Notch信号通路活性的基础上，进一步发现dnNotch1能导致BMP9诱导iMEF早晚期成骨分化能力减弱，提示Notch1具有促进BMP9诱导MSCs成骨分化作用，与我们前期研究[18]结果相一致；但与文献[16, 17, 18, 19]提出Notch1抑制MSCs成骨分化观点不一致。导致造成此种差异的原因可能有：①研究所用细胞系的不同、同一细胞系分化阶段和动物背景的不同；②诱导MSCs成骨分化条件不同，有的是用BMP2诱导，而本实验是用BMP9诱导；③使用的载体系统不同，有的是逆转录病毒，有的是腺病毒；④构建载体所用启动子变异，有研究发现，当NICD cDNA置于长度是2.3 kb的CollaⅠ启动子时，转基因鼠呈现高骨量的表型[20]；而当NICD cDNA置于长度是3.6 kb的CollaⅠ启动子时，转基因鼠呈现低骨量的表型，而患上骨质疏松症[21]；⑤体内外环境的差异，体内环境较体外环境更复杂，除Notch1信号外，还有其他多种信号通路和分子参与MSCs向成骨分化的调控，如BMP、Wnt、Hedgehog和MAPK等信号通路[22]，而且多条信号通路间存在交互串话，共同调节着MSCs的成骨分化。
综上所述，本研究证实dnNotch1抑制BMP9诱导iMEF向成骨分化，支持Notch信号通路促进BMP9诱导MSCs成骨分化的观点，但Notch1信号通路乃至整个Notch在不同情况下参与MSCs成骨分化的具体机制还需要进一步研究。
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